V - 1 - La limite de Hayflick 
            V – 2 – Etapes générales de la culture cellulaire 
            V - 3 - Comptage des cellules sur Malassez
            V - 4 - Essais de thérapie cellulaire
V - 1 - La limite de Hayflick :                                                                    

La culture cellulaire désigne un ensemble de techniques utilisées pour faire croîre des cellules hors de leur organisme ("ex-vivo") ou de leur milieu d'origine, dans un but d'expérimentation scientifique ou de fécondation in vitro.
        La détermination des exigences pour la mise au point de milieux et celle des conditions de cultures cellulaires suppose une bonne connaissance des conditions qui prévalent dans le milieu intérieur.

Lorsque les cellules mises en culture proviennent de cellules "saines" prélevées fraîchement d'un organisme (biopsie,...), on parle alors de "culture primaire". Ces cellules ne peuvent habituellement pas être maintenues en culture indéfiniment, notamment à cause de leur nombre limité de divisions (limite de Hayfklick).

La limite de Hayflick a été découverte par Leonard Hayflick en 1965 qui avait observé que des cellules en division (mitose) dans une culture cellulaire ne se divisaient que 50 fois avant de mourir. Quand des cellules approchaient cette limite, elles montraient des signes de sénescence. Cette limite varie en fonction du type cellulaire, et plus encore en fonction du type de l'organisme. La limite pour l'homme se situe aux environs de 52. Cette limite a été reliée au raccourcissement des télomères. 

Les cellules ayant une capacité de division non limitée (on parle d’immortalité en culture) sont des "lignées cellulaires". Les lignées sont soit des cellules cancéreuses (telles les cellules HeLa à développement très rapide, de Henrietta Lacks), soit des cellules en voie de cancérisation, soit des cellules saines rendues "immortelles" artificiellement.

 
NB : Les cancers ne deviennent problématiques que si les cellules qui les constituent ont trouvé le moyen de contourner la limite de Hayflick. De telles cellules sont appelées « cellules immortelles ». Ces cellules immortelles finissent quand même par mourir, mais l'ensemble des cellules rendues immortelles n'est pas limité quant au nombre de divisions cellulaires pouvant se réaliser en son sein.

 

V - 2 - Étapes générales de la culture cellulaire :                                                

-                           On décongèle une ou plusieurs ampoules de cellules. Cette ampoule contient des cellules dans un milieu de culture adapté + un agent protecteur (qui permet d'éviter une trop grande mortalité lors de la congélation. Le DMSO par exemple, qui est d'autre part toxique pour les cellules vivantes).

-                           Après la décongélation on élimine l'agent protecteur par centrifugation puis on rajoute du milieu de culture adapté frais. Certaines cellules sont cultivées en suspension dans leur milieu nutritif (cellules non-adhérentes), d'autres sur des plastiques traités leur offrant des capacités d'adhérence. Ces supports peuvent prendre la forme de boîtes de différents formats ou de "flasks".

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-                           Enfin, on remet les cellules à l'incubateur pour les cultiver. Ainsi, les cellules sont généralement cultivées en incubateurs, à une température de 37°C et dans une atmosphère très humide à teneur en CO2 contrôlée, souvent 5%.

 Les cellules sont obsevées et la culture est suivie grâce à un microscope à phase inversée

V - 3 - Comptage des cellules sur Malassez :                                                        

Une cellule de numération est une lame porte objet dans laquelle est creusée une chambre de comptage de volume connu. C’est une lame épaisse en verre, comportant des rigoles et un quadrillage.

La cellule de Malassez possède un quadrillage spécifique comportant 100 rectangles :  

Parmi les 100 rectangles totaux, on trouve donc 25 rectangles qui sont divisés en 20 petits carrés afin de faciliter le comptage.

- le volume correspondant au quadrillage total est égal à 1 mm³  (= 100x2,5 x 0,2 x 0,20)

- chaque rectangle correspond à un volume 100 fois plus faible, soit 0,01 mm³ 

V - 4 - Essais de thérapie cellulaire :                                                               

Contrairement aux méthodes thérapeutiques classiquement utilisées en médecine et basées sur l'emploi de médicaments chimiques, la thérapie cellulaire est fondée sur l'utilisation de cellules vivantes. Cette technique consiste à prélever des cellules soit chez le patient à traiter, soit chez un donneur, éventuellement de les purifier, de les modifier et de les amplifier. Ces cellules seront alors réimplantées chez le malade pour compenser le dysfonctionnement d'un tissu ou d'un groupe cellulaire. 

La thérapie cellulaire étant basée sur l'utilisation de cellules souches capables de se renouveler, par division et multiplication et peuvent donner naissance à différents types de cellules aux fonctions spécifiques diverses. voir l'animation correspondante dans le tableau des ressources ou cliquez ici. 

Pour produire des cultures humaines de cellules souches embryonnaires, on récupère des cellules de la masse intérieure d'un blastocyste humain. ces cellules sont caractérisées par leur caractère de pluripotence. Elles sont ensuite déposées dans des boites de pétri contenant le milieu de croissance et du sérum de veau foetal qui contient tous les facteurs de croissance nécessaires. Les fibroblastes embryonnaires de souris présentes dans les boites de pétri constituent une matrice d'ancrage pour les cellules issues de la masse interne du blastocyste. Ces fibroblastes ont été irradiés (rayonnement gamma) pour qu'ils ne puissent pas se diviser. Après 9 à 15 jours, des dômes de cellules apparaissent. C'est le résultat d'un division des cellules issue de la masse interne du blastocyste. Les cellules se trouvant à la périphérie des dômes seront dissociées chimiquement ou mécaniquement afin de les "réétaler" sur de nouvelles boites de pétri (dans les mêmes conditions de culture).