IV - 1 - Principe :
            IV - 2 - Utilisation des fluorochromes :
            IV - 3 - Affichage et analyse des résultats :
            IV – 4 – Cytomètre trieur :
            IV - 5 - Applications :
            

IV - 1 - Principe :                                                                                                                      

La cytométrie en flux est une technique d’analyse multiparamétrique sur plusieurs milliers de cellules isolées dont l’objectif est de compter des cellules essentiellement en fonction de leur taille et/ou des molécules qu’elles expriment à leur surface. Les mesures simultanées de caractéristiques physiques et biologiques sont effectuées isolément sur chacune des cellules, lorsque, entraînée par un fluide au centre d’une veine liquide, une cellule traverse la source d’excitation lumineuse (faisceau laser). Après intersection du rayon incident, la cellule diffracte la lumière. L’intensité de la lumière diffractée dans l’axe (angle<12°), est proportionnelle à la taille de la cellule (FSC : Forward scatter ou diffraction frontale) ; celle difractée à 90° est représentative de son contenu cytoplasmique ou granulosité (SSC : side scatter ou diffraction latérale). 

 

        

IV - 2 - Utilisation des fluorochromes :                                                                                 

Les cellules peuvent être marquées ou non par un ou des fluorochrome(s). 

Des photomultiplicateurs mesurent la fluorescence des cellules: la combinaison de plusieurs filtres permet d’analyser plusieurs signaux en même temps (jusqu’à 7) : signaux rouges, verts, oranges... 

L’ensemble des signaux détectés par le système optique est amplifié, convertis en signaux électroniques puis en valeurs numériques.

IV - 3 - Affichage et analyse des résultats :                                                                       

L’affichage simultané des paramètres, FSC, SSC traités par un logiciel, visualise chaque cellule sur écran sous forme de point. C’est le cytogramme, nuage de signaux punctiformes qui apparaît. On peut distinguer ainsi les hématies (pas de noyau) des lymphocytes, des monocytes et des polynucléaires ; Le résultat donne le % de cellules qui expriment un marqueur donné. Il est possible également de connaître le nombre d’exemplaires de la molécule recherchée exprimés à la surface membranaire d’une cellule.

IV - 4 - Cytomètre trieur :                                                                                                            

Le cytofluorimètre analyseur peut être équipé pour devenir trieur de cellules. Les cellules repérées sont déviées vers un tube collecteur et ainsi isolées.

 IV - 5 - Applications :
                                                                           

Etude du cycle cellulaire (double marquage Iodure de propidium ou Hoescht 33342 : ADN répliqué, et le Bromure d’Ethidium : taux de synthèse de l’ADN) (Taux d’ADN anormaux dans les tumeurs).

Etude des chromosomes humains (Hoescht 33258 : bases de l’ADN) et même végétaux.

Classification des cellules hématopoïétiques (par leur phénotype membranaire et leur contenu en acides nucléiques); 

Etude des cellules de l’immunité (CD4, CD8, CD3, CD2, CD19… etc.) : voir l'exemple donné dans le tableau des ressources sur l'étude de l'expression du récepteur de l'IL-27 sur les lymphocytes B ou cliquez ici.