COURS DE
TECHNIQUES IMMUNOLOGIQUES


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Chapitre VI - Etude du complément
           
            VI - 1 -
Nomenclature
            VI – 2 – 
Activation du complément
            VI - 2 - 1 - la voie classique
            VI - 2 - 2 - la voie alterne
            VI - 3 - 
La génétique du complément
           
VI – 4 – L
es récepteurs cellulaires des composants du complément
       
VI – 5 – Activités biologiques du complément
            V
I – 6 – Les réactions de fixation du complément
            V
I – 6 - 1 - Réactions faisant intervenir toutes les fractions du complément (de C1 à C9)          
            VI - 6 - 2 - Réactions faisant intervenir certaines fractions du complément          

Le complément (C) a un rôle central dans la réponse immunitaire normale vis-à-vis des agents infectieux et des autres Ag exogènes. Il représente, avec les Ac (en complément), l'élément essentiel du système humoral de défense contre les agents infectieux (bactéries).

Les protéines du complément sont soit solubles, en majeure partie dans le plasma sanguin, soit associées aux membranes cellulaires. La vingtaine de protéines plasmatiques représente 4 à 5 % du total des protéines sériques, soit une concentration globale d'environ 300 mg/100 ml de sérum.

 

VI - 1 - Nomenclature :                                                                          

-         Chacun des composants de la voie classique et de la voie effectrice commune (ou voie terminale) est noté par la lettre C suivie d'un chiffre (de C1… jusqu’à C9).

-         Les composants de la voie alterne sont appelés facteurs et désignés par une lettre majuscule, ex. facteur B, facteur D, properdine (P). Les protéines de contrôle sont appelées par leur nom et désignées par les abréviations suivantes : inhibiteur de la C1-estérase (C1-inh), C4 binding-protein (C4-bp)… etc.

-         Les fragments de clivage enzymatique sont représentés par des lettres minuscules : ex. C4a, C4b, C4c, C4d. Les formes actives des composants sont représentées recouvertes par une barre horizontale, ex. C1r, C1s. La lettre i désigne une molécule inactive, ex. C3bi. Les chaînes polypeptidiques des protéines à structure quaternaire sont désignées par des lettres grecques :  pour la plus lourde, puis et ensuite , ex. C4, C4 et C4 .

VI - 2 - Activation du complément :                                                               

Les composants du complément s’activent en cascade, suite à des clivages successifs conduisant à la formation de fragments possédant des activités biologiques diverses. Le 1er composé à activité protéolytique clive spécifiquement le 2ème composé en deux fragments dont l’un acquiert lui-même une activité protéolytique spécifique pour le 3ème composé et ainsi de suite... Chaque enzyme pouvant activer de nombreuses molécules du précurseur suivant (de 6 à 1200), chaque étape est donc amplifiée. Les protéines du complément forment 2 cascades enzymatiquement parallèles et distinctes aboutissant à une unité terminale commune. Les deux voies d’activation sont déclenchées soit par la formation du complexe immun Ag-Ac pour la voie classique, ou par des micro-organismes pour la voie alterne.



VI - 2 - 1 - La voie classique :                                                                     

La voie classique comprend 5 protéines : C1q, C1r, C1s, C4 et C2 qui sont responsables de l'assemblage de l'enzyme C3-convertase classique (C14b2a) et 3 protéines de contrôle : le C1-inh (C1-inhibiteur ou inhibiteur de la C1-estérase), la C4-bp (C4-binding protein) et le facteur I. Cette voie est initiée par l’interaction du C1 (comprenant 3 sous unités C1q, C1r, C1s) avec des complexes Ag-Ac ou des Ig agrégées. Le composant C1q, en forme d’un bouquet de 6 tulipes, reconnaît la partie Fc des Ig suivantes : IgM, IgG3, IgG1 et IgG2. 

L’association Ag-Ac-C1q sur la membrane cellulaire active le C1r en présence d’ions Ca++, puis le C1s, qui à son tour active C4 et C2 en leur enlevant les morceaux C4a et C2a. Le composant C14b2a est désigné par l’appellation C3 convertase de la voie classique. Cette dernière convertit C3 en C3a et C3b. Ce dernier se dépose à proximité du site de clivage et constitue avec les précédents fragments la C5 convertase de la voie classique.

VI - 2 - 2 - La voie alterne :                                                                                                            
La voie alterne est initiée (en absence d’Ac) directement à partir du composant C3, qui est mis en contact avec des substances polysaccharidiques retrouvées dans les membranes bactériennes, celles des globules rouges de lapins …etc. Le composant C3b forme un complexe avec le composant B. Ce dernier devient clivable et la C3 convertase de la voie alterne est formée. La C5 convertase est ensuite formée par le clivage à nouveau du C3.

NB : A la voie classique on rattache la voie des lectines (Celle-ci est mise en jeu par la liaison d'une protéine, la MBP (protéine liant le mannose, ou Mannose Binding Protein) au mannose des parois de certaines bactéries).

Ces 3 cascades enzymatiques, reliées entre elles, aboutissent au clivage du C3, événement clé du système complémentaire : un troisième groupe de protéines plasmatiques s'assemble alors dans les structures membranaires (voie effectrice commune aboutissant au complexe d'attaque membranaire [MAC]) entraînant des lésions lytiques des doubles couches lipidiques membranaires.

VI - 3 - La génétique du complément :                                                                

La localisation chromosomique de la plupart des composants est actuellement connue : chaîne A et B du C1q, chaînes et du C8 sur le chromosome 1p ; facteur H, CR1 et CR2 sur le chromosome 1q ; B, C2 et C4 sur le chromosome 6 au sein du MHC ; C1r et C1s sur le chromosome 12… etc. Des déficits héréditaires ont été décrits pour presque tous les composants du complément. Il s'agit le plus souvent de déficits de synthèse, moins fréquemment de déficits fonctionnels (protéine présente mais biologiquement inactive). Le plus fréquent concerne le C1-inh, à transmission autosomique dominante, responsable de l'oedème angio-neurotique héréditaire.

VI - 4 - Les récepteurs cellulaires des composants du complément :                                 

On les retrouve à la surface de nombreuses sous-populations cellulaires. Tous ces récepteurs (sauf celui du facteur H) interagissent uniquement avec la forme active, clivée, du composant ; ils ont très peu, si ce n'est aucune, affinité pour la forme native.

VI - 5 - Activités biologiques du complément :                                                           

-         Lésions membranaires : Par activation du MAC le complément entraîne directement (sans liaison à un récepteur) la lyse osmotique des cellules. Certaines cellules tumorales sont résistantes à la lyse par le MAC, et certaines bactéries n'y sont sensibles qu'en présence de co-facteurs (ex. le lysozyme).

-         Phagocytose par opsonisation : les cellules hostiles sont rendues vulnérables à la phagocytose après adhésion d’opsonines. Les monocytes, les macrophages et les polynucléaires ont un récepteur pour le C3b  et le fragment Fc  des IgG. L’adhérence et la phagocytose des bactéries recouvertes d’IgG sont favorisées par la fixation du C3b, mais elles surviennent aussi en l’absence de complément et, réciproquement, le C3b à lui seul a aussi une action opsonisante. Ce rôle du C3b est particulièrement important au début de la réponse immunitaire, en présence d’IgM non opsonisantes, ou même avant le développement de l’immunité spécifique dans le cas des bactéries Gram négatif qui activent directement la voie alterne.

-         Rôle dans l'inflammation : En réponse au C3a, C4a et C5a (petits peptides de faible PM ~10 kD, actifs à faibles [] pM ou nM, appelés anaphylatoxines), les mastocytes, basophiles et plaquettes libèrent des amines vasoactives (histamine, sérotonine) qui participent à la réaction inflammatoire. La C5a (20X plus active) seule est douée de puissantes propriétés chimiotactiques pour les leucocytes, les attirant au niveau du foyer inflammatoire et entrainant la libération d’enzymes lysosomiales. Ces anaphylatoxines sont clivées in vivo par la carboxypeptidase N plasmatique.

-         Interactions avec les lymphocytes : De nombreuses cellules immunocompétentes expriment à leur surface des récepteurs du complément. Le complément pourrait ainsi moduler la réponse immunitaire. Des antigènes, libres ou sous forme de complexes immuns, recouverts de C3b ou C3bi, peuvent être présentés par les cellules folliculaires dendritiques et stimuler les Lc B.

-        Autres fonctions du complément : Le complément est capable de neutraliser certains virus (C1, C4, C2). Enfin il existe de nombreuses interconnections avec le système de la coagulation, notamment par le biais du C1-inh.

 
VI - 6 - Les Réactions de fixation du complément :                                                  

Il s'agit des réactions de fixation du complément par les Ac ayant réagi avec les Ag correspondants; Ces Ac fixant le C sont chez l'homme les IgG1, IgG2, IgG3 et les IgM.

VI - 6 - 1- Réactions faisant intervenir toutes les fractions du C (de C1 à C9) :                    


A/Réaction de fixation du C hémolytique
. Elle se déroule en quatre temps :

* 1er temps : chauffage 30 mn à 56°C pour détruire le C du sérum à tester.
* 2ème temps : mise en contact du sérum avec l'Ag
* 3ème temps : addition de C en quantité connue.
* 4ème temps : addition de globules rouges de mouton (GRM) et d'Ac anti-GRM.
Si le sérum ne contient pas d'Ac, il n'y a pas formation de complexes Ag-Ac au cours du 2ème temps, le C ajouté au 3ème temps n'est pas utilisé et reste disponible pour intervenir au 4ème temps et conduire à la lyse de GRM recouverts d'Ac anti-GRM. Ceci se traduit par la présence d'hémoglobine dans le surnageant. Inversement, la présence d'Ac dans le sérum entraîne la formation de CI au 2ème temps qui consommeront le C au 3ème temps. Le 4ème temps se déroule alors en l'absence de C, donc la lyse des GRM par les Ac anti-GRM n'aura pas lieu.

B/Réaction de lyse des liposomes : On peut faire appel à la place des GRM à des liposomes analogues structuraux artificiels de la membrane cytoplasmique. Il s'agit de sphères formées par une membrane artificielle constituée de lécithine, de cholestérol et de phospholipides. Des Ag solubles sont introduits dans cette membrane et s'expriment à sa surface. Un marqueur, par exemple du galactose en solution, est piégé à l'intérieur de la sphère. La fixation des Ac, puis du C sur la membrane synthétique, produit des pores par lesquels le galactose du liposome s'échappe. Il suffit alors de le doser pour apprécier l'intensité de la réaction.

C/Réaction de cytolyse par le C : La fixation du C par des Ac fixés sur des Ag portés par une cellule vivante provoque la lyse de la cellule ou tout au moins des lésions de sa membrane. Lorsqu'il s'agit d'hématies, les lésions sont objectivées par la libération d'hémoglobine dans le milieu. Lorsqu'il s'agit de cellules nucléées, ces lésions s'accompagnent d'anomalies variées. Dans le cas des toxoplasmes (test de Sabin et Feldman), ces parasites n'excluent plus un colorant vital (bleu Trypan), aussi les cellules lésées se colorent-elles en bleu alors que les toxoplasmes intacts restent incolores. Pour le sérodiagnostic de la syphilis, la fixation des Ac, puis du C, sur des tréponèmes vivants inhibe leur mobilité. Les tréponèmes intacts restent mobiles, ceux qui ont été lésés, restent immobiles (test de Nelson ou test d'immobilisation des tréponèmes). Le système peut être généralisé à toutes les cellules qu'il suffit de marquer au 51Cr. La fixation des Ac et du C altère les cellules qui relarguent alors du 51Cr dans le surnageant de culture. Pour apprécier la cytolyse, il suffit de compter la radioactivité du surnageant.

VI - 6 - 2- Réactions faisant intervenir certaines fractions du C :                                     

A/Immunoadhérence (hématies et plaquettes de primates) et opsonisation (phagocytes). Ce sont des réactions qui font intervenir des cellules (hématies et plaquettes humaines ou de singe, leucocytes) ayant un récepteur pour le C3. Des Ag particulaires (bactéries, virus...), après liaisons avec leurs Ac, activent le C jusqu'à C3, et grâce à ce dernier se fixent sur les cellules précédentes.
De telles réactions servent in vitro pour révéler la réaction Ag-Ac-C, mais elles jouent aussi in vivo un rôle physiologique dans la défense contre les agents infectieux puisqu'elle favorise la phagocytose.

B/Réaction de fixation du C1q marqué. Le sérum à étudier est incubé avec du C1q marqué par un isotope radioactif. Dans un deuxième temps le C1q libre et le C1q lié aux complexes Ag-Ac, sont séparés par précipitation différentielle à l'aide de polyéthylène glycol. La mesure de la radioactivité de la fraction contenant les CI permet de les doser. Cette méthode est plus particulièrement appliquée pour la mise en évidence de CI circulants préformés dans le sérum de malades.


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Auteur :
Mme BOUMENDJEL-Messarah Amel
(email : amelibis@yahoo.fr)
Docteur en immunologie. Maître de conférences (A)
Laboratoire de Recherche en Biochimie et Microbiologie Appliquées. Unité d’immunologie. Département de biochimie. Faculté des Sciences.
Université Badji Mokhtar d’Annaba (Algérie).